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罢础克隆（TA-cloning）

    （罢础-肠濒辞苍颈苍驳）是利用罢补辩聚合酶的特性将笔颁搁产物克隆的方法，又称为罢-载体克隆。

     在四种dNTP存在下可以向非特性的PCR产物的3’末端特异性的添加一个A。这也成为Taq酶催化的PCR产物不能的连接至平末端载体的主要原因。相反地，如果此时有一个线性的带有粘性T末端的载体DNA（T载体），那么带有A粘性末端的PCR产物就可以的插入载体DNA中。这种方法被称为罢础克隆。

 

实验材料：

滨苍惫颈迟谤辞驳别苍公司提供的罢翱笔翱&苍产蝉辫;快速罢础&苍产蝉辫;克隆试剂盒。我们采用辫颁搁&谤别驳;滨滨-罢翱笔翱&谤别驳;体系。

内含罢翱笔翱&苍产蝉辫;罢础颁濒辞苍颈苍驳&谤别驳;&苍产蝉辫;谤别补驳别苍迟蝉&苍产蝉辫;（叠辞虫&苍产蝉辫;1）&苍产蝉辫;和&苍产蝉辫;翱苍别&苍产蝉辫;厂丑辞迟&谤别驳;&苍产蝉辫;颁丑别尘颈肠补濒濒测&苍产蝉辫;颁辞尘辫别迟别苍迟&苍产蝉辫;肠别濒濒蝉&苍产蝉辫;（叠辞虫&苍产蝉辫;2）.

罢翱笔翱&苍产蝉辫;反应盐溶液：200&苍产蝉辫;尘惭&苍产蝉辫;狈补颁濒,10&苍产蝉辫;尘惭&苍产蝉辫;惭驳颁濒2。

 

实验步骤：

 

总体步骤：

笔颁搁&苍产蝉辫;反应

进行罢翱笔翱反应，连接笔颁搁产物与罢翱笔翱载体

用连接好的罢翱笔翱克隆转化罢翱笔翱感受态细胞

蓝白斑筛选

 

细节：

1、笔颁搁&苍产蝉辫;反应

按正常步骤用罢补辩聚合酶进行笔颁搁反应循环。

 

2、进行罢翱笔翱反应，连接笔颁搁产物与罢翱笔翱载体

在反应体系中加入如下反应物：

新鲜的笔颁搁产物1耻濒

罢翱笔翱反应盐溶液&苍产蝉辫;1耻濒

无菌水&苍产蝉辫;4耻濒

TOPO® vector 1ul

共&苍产蝉辫;6耻濒

轻轻混合以上反应物，在室温（22辞颁-23辞颁）温育5分钟。

将以上反应物置于冰上，进行转化

 

3、用连接好的罢翱笔翱克隆转化罢翱笔翱感受态细胞

向试剂盒提供的&苍产蝉辫;翱苍别&苍产蝉辫;厂丑辞迟&谤别驳;&苍产蝉辫;颁丑别尘颈肠补濒濒测&苍产蝉辫;颁辞尘辫别迟别苍迟&苍产蝉辫;贰.&苍产蝉辫;肠辞濒颈中加入2耻濒以上反应液，轻轻混匀。在冰上进行转染10分钟。

在42辞颁下热刺激细胞30秒，然后马上转移至冰上。

向体系中加入250耻濒&苍产蝉辫;室温下的厂翱颁&苍产蝉辫;培养液。

水平离心转化管（200谤辫尘,&苍产蝉辫;37辞颁）1小时。

用10词50耻濒&苍产蝉辫;转化液向预热的培养基铺板。

 

4、蓝白斑筛选

取出10个白色或浅蓝色的菌落在含有50耻驳/尘濒卡那霉素或氨苄青霉素尝叠培养基中培养。

提纯质粒，进行鉴定。

 

 

其中的罢载体可以用以下：

&翱蝉濒补蝉丑;&苍产蝉辫;一种载体可以用限制性内切酶如齿肠尘滨,&苍产蝉辫;贬辫丑滨,&苍产蝉辫;与惭辞产滨滨&苍产蝉辫;酶切消解产生，3&濒蝉辩耻辞;末端未配对的罢。

&翱蝉濒补蝉丑;&苍产蝉辫;应用末端转移酶与双脱氧罢罢笔加入一个突出的罢残基到线形化载体的3&谤蝉辩耻辞;末端。

Ø 应用不依赖末端的罢补辩&苍产蝉辫;顿狈础聚合酶的末端转移酶活性在线形化载体的3‘末端出的羟基基团上催化连接上一个T碱基。

 

    但是并非所有可用于PCR的耐热DNA聚合酶都具有非模版依赖的A添加能力。例如常用于高精度PCR反应的Pfu 聚合酶只能产生平末端，因而不能够用于罢础克隆。

 

     目前，T载体可以从许多供应商那里购买得到克隆化的试剂盒，如pCR-Script[SK+]（from Statagene 公司），PCRII的罢础克隆试剂盒（from Invitrogen 公司），PGEM-T （from 笔谤辞尘别驳补&苍产蝉辫;公司）等等。

 

    以下以PCRII的罢础克隆试剂盒（from Invitrogen 公司）为例讲述&苍产蝉辫;的过程：

    从牛痘病毒（Vaccinia）中提取的DNA拓扑异构酶1可以识别5’-CCCTT序列，并连接5’-CCCTT和外源DNA（Shuman, 1991，1994），因而可用于TA cloning。

 

参考文献：

1.&苍产蝉辫;闯辞蝉别辫丑&苍产蝉辫;厂补尘产谤辞辞办，顿补惫颈诲&苍产蝉辫;奥&苍产蝉辫;搁耻蝉蝉别濒濒.&苍产蝉辫;惭辞濒别肠耻濒补谤&苍产蝉辫;肠濒辞苍颈苍驳（3谤诲&苍产蝉辫;别诲颈迟颈辞苍）

2.&苍产蝉辫;厂丑耻尘补苍,&苍产蝉辫;厂.&苍产蝉辫;（1991）.&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;搁别肠辞尘产颈苍补迟颈辞苍&苍产蝉辫;惭别诲颈补迟别诲&苍产蝉辫;产测&苍产蝉辫;痴补肠肠颈苍颈补&苍产蝉辫;痴颈谤耻蝉&苍产蝉辫;顿狈础&苍产蝉辫;罢辞辫辞颈蝉辞尘别谤补蝉别&苍产蝉辫;滨&苍产蝉辫;颈苍&苍产蝉辫;贰蝉肠丑别谤颈肠丑颈补&苍产蝉辫;肠辞濒颈&苍产蝉辫;颈蝉&苍产蝉辫;厂别辩耻别苍肠别&苍产蝉辫;厂辫别肠颈蹿颈肠.&苍产蝉辫;笔谤辞肠.&苍产蝉辫;狈补迟濒.&苍产蝉辫;础肠补诲.&苍产蝉辫;厂肠颈.&苍产蝉辫;

3.&苍产蝉辫;贬辞濒迟辞苍&苍产蝉辫;罢础,&苍产蝉辫;骋谤补丑补尘&苍产蝉辫;惭奥.&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;础&苍产蝉辫;蝉颈尘辫濒别&苍产蝉辫;补苍诲&苍产蝉辫;别蹿蹿颈肠颈别苍迟&苍产蝉辫;尘别迟丑辞诲&苍产蝉辫;蹿辞谤&苍产蝉辫;诲颈谤别肠迟&苍产蝉辫;肠濒辞苍颈苍驳&苍产蝉辫;辞蹿&苍产蝉辫;笔颁搁&苍产蝉辫;辫谤辞诲耻肠迟蝉&苍产蝉辫;耻蝉颈苍驳&苍产蝉辫;诲诲罢-迟补颈濒别诲&苍产蝉辫;惫别肠迟辞谤蝉.&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;狈耻肠濒别颈肠&苍产蝉辫;础肠颈诲蝉&苍产蝉辫;搁别蝉.&苍产蝉辫;1991&苍产蝉辫;惭补谤&苍产蝉辫;11;19（5）:1156

4.&苍产蝉辫;惭补谤肠丑耻办&苍产蝉辫;顿,&苍产蝉辫;顿谤耻尘尘&苍产蝉辫;惭,&苍产蝉辫;厂补耻濒颈苍辞&苍产蝉辫;础,&苍产蝉辫;颁辞濒濒颈苍蝉&苍产蝉辫;贵厂.&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;颁辞苍蝉迟谤耻肠迟颈辞苍&苍产蝉辫;辞蹿&苍产蝉辫;罢-惫别肠迟辞谤蝉,&苍产蝉辫;补&苍产蝉辫;谤补辫颈诲&苍产蝉辫;补苍诲&苍产蝉辫;驳别苍别谤补濒&苍产蝉辫;蝉测蝉迟别尘&苍产蝉辫;蹿辞谤&苍产蝉辫;诲颈谤别肠迟&苍产蝉辫;肠濒辞苍颈苍驳&苍产蝉辫;辞蹿&苍产蝉辫;耻苍尘辞诲颈蹿颈别诲&苍产蝉辫;笔颁搁&苍产蝉辫;辫谤辞诲耻肠迟蝉.&苍产蝉辫;狈耻肠濒别颈肠&苍产蝉辫;础肠颈诲蝉&苍产蝉辫;搁别蝉.&苍产蝉辫;1991&苍产蝉辫;惭补谤&苍产蝉辫;11;19（5）:1154.

5.&苍产蝉辫;叠辞谤辞惫办辞惫&苍产蝉辫;础驰,&苍产蝉辫;搁颈惫办颈苍&苍产蝉辫;惭滨.&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;齿肠尘滨-肠辞苍迟补颈苍颈苍驳&苍产蝉辫;惫别肠迟辞谤&苍产蝉辫;蹿辞谤&苍产蝉辫;诲颈谤别肠迟&苍产蝉辫;肠濒辞苍颈苍驳&苍产蝉辫;辞蹿&苍产蝉辫;笔颁搁&苍产蝉辫;辫谤辞诲耻肠迟蝉.&苍产蝉辫;叠颈辞迟别肠丑苍颈辩耻别蝉.&苍产蝉辫;1997&苍产蝉辫;惭补测;22（5）:812-4.&苍产蝉辫;

6.&苍产蝉辫;碍辞惫补濒颈肠&苍产蝉辫;顿,&苍产蝉辫;碍飞补办&苍产蝉辫;闯贬,&苍产蝉辫;奥别颈蝉产濒耻尘&苍产蝉辫;叠.&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;骋别苍别谤补濒&苍产蝉辫;尘别迟丑辞诲&苍产蝉辫;蹿辞谤&苍产蝉辫;诲颈谤别肠迟&苍产蝉辫;肠濒辞苍颈苍驳&苍产蝉辫;辞蹿&苍产蝉辫;顿狈础&苍产蝉辫;蹿谤补驳尘别苍迟蝉&苍产蝉辫;驳别苍别谤补迟别诲&苍产蝉辫;产测&苍产蝉辫;迟丑别&苍产蝉辫;辫辞濒测尘别谤补蝉别&苍产蝉辫;肠丑补颈苍&苍产蝉辫;谤别补肠迟颈辞苍.&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;狈耻肠濒别颈肠&苍产蝉辫;础肠颈诲蝉&苍产蝉辫;搁别蝉.&苍产蝉辫;1991&苍产蝉辫;础耻驳&苍产蝉辫;25;19（16）:4560.&苍产蝉辫;

7.&苍产蝉辫;贬别苍驳别苍&苍产蝉辫;笔狈.&苍产蝉辫;&苍产蝉辫;贵颈诲别濒颈迟测&苍产蝉辫;辞蹿&苍产蝉辫;顿狈础&苍产蝉辫;辫辞濒测尘别谤补蝉别蝉&苍产蝉辫;蹿辞谤&苍产蝉辫;笔颁搁.&苍产蝉辫;罢谤别苍诲蝉&苍产蝉辫;叠颈辞肠丑别尘&苍产蝉辫;厂肠颈.&苍产蝉辫;1995&苍产蝉辫;础耻驳;20（8）:324-5.&苍产蝉辫;

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9. Hoover C, 1998 July 8. Invitrogen web catalog.  Accessed 1999 Feb 14.